Diagnose von Quarantäneschadorganismen am Julius Kühn-Institut im nationalen Referenz­laboratorium für Schadorganismen der Pflanzen

Diagnosis of quarantine organisms at the JKI in the National Reference Laboratory for organisms harmful to plants

Journal für Kulturpflanzen, 72 (8). S. 404–414, 2020, ISSN 1867-0911, DOI: 10.5073/JfK.2020.08.11, Verlag Eugen Ulmer KG, Stuttgart

Kontaktanschrift

Dr. Clovis Douanla-Meli, Julius Kühn-Institut (JKI) – Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Institut für Nationale und Internationale Angelegenheiten der Pflanzengesundheit, Messeweg 11/12, 38104 Braunschweig, E-Mail: clovis.douanla-meli@julius-kuehn.de

Zur Veröffentlichung angenommen

3. Juli 2020

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Grundlage für die Ernennung des JKI zum NRL für Deutschland ist der Artikel 7 (2) des Pflanzenschutz­gesetzes (PflSchG, (DE, 2012)). Hier ist festgehalten, dass das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL) ermächtigt wird, dem JKI die Funk­tion eines nationalen Referenzlaboratoriums mit den dazu­gehörigen Aufgaben zuzuweisen. Die Ernennung des JKI zum NRL erfolgte durch das BMEL mit Wirkung ab 11. April 2019 mit der „Verordnung zur Zuweisung der Funktion eines nationalen Referenzlaboratoriums für Schadorganismen der Pflanzen“ vom 10. April 2019 (Pflanzenschadorganismenreferenzlaborzuweisungsver­ordnung, PflSchadORZV, (DE, 2019)). Das JKI ist damit seit April 2019 das offizielle Nationale Referenzlaboratorium für Schadorganismen der Pflanzen in Deutschland.

Die EU-Verordnung 2017/625 regelt nicht nur die Ernen­nung von EU- und nationalen Referenzlaborato­rien für Schadorganismen der Pflanzen. Verbunden mit der Funktion eines NRL sind bestimmte Zuständigkeiten und Aufgaben, die insbesondere in Artikel 101 dieser EU-Verordnung geregelt sind.

Die NRLs sind den jeweiligen EU-Referenzlaboratorien (EURL) demnach gegenüber zur Zusammenarbeit verpflichtet. Auf EU-Ebene sind die Referenzlabore nach Dele­gierter Verordnung (EU) 2018/631 (EU, 2018) für die Bereiche (a) Insekten und Milben, (b) Nematoden, (c) Bakterien, (d) Pilze und Oomyceten, (e) Viren, Viro­ide und Phytoplasmen, zuständig (siehe Tab. 1 für die Verantwortungsbereiche des NRL JKI). Die NRLs nehmen an internationalen Workshops, Schulungen, und Eignungsprüfungen bzw. Laborvergleichsuntersuchungen teil, die von den EURLs ausgerichtet werden. Die Ergebnisse dieser Eignungsprüfungen werden zur Qualitätssicherung an die EU-Kommission übermittelt.

Die Verordnung legt auch Kriterien für die Zusammenarbeit mit amtlichen Laboratorien in den jeweiligen Mitgliedstaaten fest. Dazu gehört, dass das NRL dafür Sorge trägt, dass die in der Diagnose von Schadorganismen verwendeten Methoden kontinuierlich harmonisiert und verbessert werden. Hierfür werden Schulungen oder Workshops für das Personal der amtlichen Laboratorien durchgeführt und Eignungsprüfungen organisiert und, sofern notwendig, Folgemaßnahmen eingeleitet und die entsprechenden Behörden darüber informiert.

Das NRL dient auch als Schnitt- und Kontaktstelle für den Fluss wichtiger Informationen vom EURL zu den amtlichen Laboratorien. Es verfügt über ein zentrales Postfach, das vom Institut AG des JKI betreut wird. Das NRL stellt, wenn vorhanden, Referenzmaterial für die amtlichen Diagnoselabore direkt zur Verfügung oder kontaktiert bzw. vermittelt alternative Quellen für Referenzmaterial, z. B. die jeweils zuständigen EURLs.

Eine wichtige Aufgabe des NRL ist es, die amtlichen Labore in den jeweiligen Bundesländern bei der Diag­nose von Schadorganismen zu unterstützen. Dies betrifft vor allem die Diagnose bei Ausbrüchen und im Falle von nicht vorschriftsmäßigen Sendungen. Auch ist die Bestätigung der Diagnoseergebnisse kritischer Fälle vorgesehen. Das NRL führt in diesen Fällen die entsprechenden Referenzuntersuchungen durch und erstellt für die Einsender der Proben, d. h. die jeweiligen Pflanzenschutzdienste der Bundesländer, Prüfberichte mit den Ergebnissen der Untersuchung der Proben. Die Durchführung von Routine-Diagnosen und Saatgutanerkennungsuntersuchungen/Pflanzgutzertifizierung ist hingegen nicht Teil der Aufgaben des NRL. In diesem Fall verbleibt die Zustän­digkeit bei den Pflanzenschutzdiensten der Bundesländer und ihren Laboren.

Für das NRL ist zudem eine Akkreditierung nach DIN EN ISO/IEC 17025 „Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien“ verpflichtend. Diese muss entsprechend der aktuellen EU-Gesetzgebung mit einer Übergangsfrist bis spätestens 29. April 2022 nach Begutachtung aller akkreditierungsrelevanten Prüfverfahren und –bereiche durch die Deutsche Akkreditierungsstelle GmbH (DAkkS) umgesetzt werden. Voraussetzung für die Diagnose von Schad­organismen mit akkreditierten Prüfverfahren ist die vorherige Etablierung eines Qualitätsmanagementsystems in allen Bereichen des JKI, die Prüfungen im Rahmen des NRL durchführen. Dazu gehört auch die regelmäßige erfolgreiche Teilnahme an Eignungsprüfungen und die Durchführung von internen System- und Prozess-Audits. Zur Sicherstellung der geforderten Leistungsfähigkeit durchlaufen sämtliche von den Laboren anzuwendende Prüfverfahren eine Validierung bzw. Verifizierung. Die Definition der Prüfverfahren bzw. ihre Dokumentation erfolgt in entsprechenden Verfahrens- und Arbeitsanweisungen, die immer aktuell gehalten und für alle Mitarbeiter zugänglich sind. Im den insgesamt auf 5 Fachinstitute verteilten 14 Prüflaboren des NRL wird das ganze Spek­trum diagnostischer Verfahren angewandt. Hierzu zählen biologische, morphologische, immunologische und molekularbiologische Verfahren.

In Ergänzung dazu ist mit der Verabschiedung der Dele­gierten Verordnung (EU) 2019/1702 (EU, 2019a) eine Liste von derzeit 20 sogenannten „Prioritären Schädlingen“ veröffentlicht worden. Diese neu kategorisierten Quarantäneschadorganismen sind dadurch charakterisiert, dass ihre potentiellen wirtschaftlichen, ökologischen oder sozialen Folgen für das Gebiet der Union als besonders schwerwiegend eingeschätzt werden.

Neben den in der EU geregelten Schadorganismen sind auch die in den EPPO-Listen (Alert Liste (Warnliste), A1- (Schadorganismus kommt im EPPO-Gebiet nicht vor) und A2-Liste (Schadorganismus kommt im EPPO-Gebiet vor, ist aber nicht weit verbreitet) aufgeführten Schadorganismen relevant.

2.1.1 Diagnose bakterieller Quarantäneschadorganismen im Institut AG (AGQB). Der Bereich Quarantänebakteriologie im Institut AG (AGQB) ist zuständig für alle Bakteriosen mit Ausnahme der Schadorganismen, die im Obstbau auftreten. Die Diagnose erfolgt schwerpunktmäßig für Clavibacter sepedonicus (Abb. 1c), den Erreger der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel sowie für Ralstonia sola­nacearum, ein Bakterium, das die Schleimkrankheit bei Kartoffeln hervorrufen und darüber hinaus weitere Wirtspflanzen wie Tomate, Aubergine und Pelargonie befal­len kann. Besonders bei der Testung von Pflanzkartoffeln ist es wichtig, dass eine sichere Diagnose dieser beiden Quarantäneschaderreger erfolgt.

Abb. 1. Beispiel einiger im NRL JKI verwendeten Geräte bzw. Methoden und ab­gedeckten Schadorga­nismen bzw. Pflanzenkrankheiten. a) Stereomikroskope (In­sektenuntersuchung). b) Droplet digital PCR (ddPCR). c) Symptome von Clavibacter sepedo­nicus an anfälligen Au­bergine-Testpflanzen. d) Schlüpfende Juvenile von Globodera pallida. e) Symptome von Schwarzfleckenkrank­heit (CBS) an Orangen und Isolat des Erregers Phyllosticta citricarpa. f-h) Nachweis des Kar­toffelkrebses (Syn­chytrium endobioticum) mittels Biotests und Nasssiebverfahren.

Außerdem erfolgt in der Quarantänebakteriologie die Diagnose weiterer, auch wirtschaftlich relevanter Schad­organismen. Dazu gehört der als prioritärer Schadorganismus eingestufte Erreger Xylella fastidiosa. Dieser Schadorganismus kann Biofilme im Xylem der Pflanzen bilden und besitzt ein extrem breites Wirtspflanzenspektrum. Dieses umfasst über 300 Wirtspflanzenarten, darunter beispielweise Oleander, Wein, Oliven und Eichen. X. fastidiosa hat mehrere Unterarten, darunter die bislang anerkannten Unterarten ssp. fastidiosa, ssp. pauca, ssp. multiplex und ssp. sandyi, die sich im Hinblick auf Wirtspflanzenspektrum und Verbreitung unterscheiden. Die Übertragung von X. fastidiosa von infizierten auf gesunde Pflanzen erfolgt durch Vektoren, die am Xylem der Pflanzen saugen. Für diesen prioritären Schadorganismus wurde ein Notfallplan für Deutschland erarbeitet und am 11.01.2019 veröffentlicht (BAnz AT 05.04.2019 B8).

Des Weiteren werden Pflanzenproben auf Vorhandensein des Bakteriums Candidatus Liberibacter solanacearum untersucht. Dieses Bakterium besiedelt das Phloem von Pflanzen und das Wirtspflanzenspektrum umfasst insbesondere Solanaceen und Apiaceen. Die Übertragung des Bakteriums erfolgt durch Vektoren. Ca. L. sola­nacearum kann in verschiedene Haplotypen unterteilt werden, die sich in Wirtspflanzen- und Vektorenspek­trum unterscheiden. Wird Candidatus Liberibacter solanacearum in einer Probe nachgewiesen, wird im nächsten Schritt mit der Methode des sog. Haplotyping anhand von Sequenzunterschieden in bestimmten Genregionen untersucht, welcher Haplotyp vorliegt.

Darüber hinaus ist AGQB Ansprechpartner für Fragen zu weiteren bakteriellen Schadorganismen wie Candidatus Liberibacter africanus, Candidatus Liberibacter americanus und Candidatus Liberibacter asiaticus, die Aus­löser der als Huanglongbing oder Citrus-Greening bezeich­neten Krankheit an Zitrus, Ralstonia pseudosolanacearum an Solanum spp., Ralstonia syzygii ssp. celebesensis an Bana­nen und ssp. indonesiensis u. a. an Kartoffeln und Toma­ten, Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfa­ciens v. a. an Gartenbohne (Phaseolus vulgaris), Pantoea stewartii ssp. stewartii v. a. an Mais (Zea mays), Xanthomonas oryzae pv. oryzae und Xanthomonas oryzae pv. oryzicola v. a. an Reis (Oryza sativa) sowie für neue Schadorganismen aus dem Bereich Bakteriologie.

Der Nachweis der Schadorganismen in pflanzlichen Materialien erfolgt schwerpunktmäßig mithilfe der mole­kularbiologischen Verfahren Real-Time PCR und konventioneller PCR.

2.1.2 Diagnose bakterieller Quarantäneschadorganismen im Institut OW (OWB). Der Nachweis des bakteriellen Quarantäneschaderregers Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Kiwikrebs) sowie die beiden Zitrus-pathogenen Pathovare von Xanthomonas citri, pv citri und pv. aurantifolii, erfolgt im Institut OW primär über spezifische PCR und quantitative PCR (qPCR)-Methoden in Kombination mit Isolierung und Multi-Locus-Sequenz-Analyse (MLSA). Ein besonderer Schwerpunkt liegt dabei auf der Entwicklung einfacher Differenzierungsmethoden zur Abgrenzung der eng verwandten Pathovare. Neben Nuklein­säure-basierten Techniken wird am Institut auch der schnelle Nachweis über Proteinmuster im MALDI-TOF Biotyping-Verfahren angewendet und für phytopatho­gene Quarantäneschaderreger weiter ausgebaut.

Nichtendemische Insekten aus anderen Teilen der Welt mit ähnlichen Klimaten wie in der EU und auch Deutschland können eingeschleppt werden und sich etablieren, wenn keine Maßnahmen getroffen werden. Als wechselwarme Organismen können sich Insekten leicht an die sich ändernden europäischen Klimabedingungen anpassen. Insbesondere ermöglichen zunehmende Temperaturen eine weitere Ausbreitung und höhere Vermehrungsraten aufgrund kürzerer Entwicklungszyklen, wodurch das Invasionspotential und damit letztendlich das Schadpotenzial steigt.

Die Vielzahl der Schadinsekten im pflanzengesundheitlichen Bereich stellt eine große Herausforderung für die Diagnose des NRL dar. Daher ist eine Aufteilung der Bestim­mung der Insektengruppen auf drei Institute des JKI erfolgt, welche durch AG (AGQE, AGQF), GF (GFE) und OW (OWE) wahrgenommen werden. Die Schadin­sekten können morphologisch und/oder molekularbio­logisch bestimmt werden. Die morphologische Bestimmung erfordert i. d. R. ein bestimmtes Entwicklungssta­dium, um eine sichere Determination zu ermöglichen. Andererseits können auch trockene und ältere Exemplare bestimmt werden. Die molekularbiologische Bestimmung der Schadinsekten setzt geeignetes DNA-Material voraus, ist aber i. d. R. in der Lage alle Entwicklungssta­dien zu bestimmen. In Wahrnehmung der Funktion als NRL befasst sich der entomologische Bereich zusätzlich auch mit ande­ren Arthropoden, wie Spinnmilben (Tetranychidae). Die gelisteten Quarantäne-Schadinsekten sind von der EU im Rahmen der Gesetzgebung festgelegt worden und grundsätzlich vom NRL diagnostisch abzudecken.

2.2.1 Diagnose von Quarantäneschadinsekten im Institut AG (AGQE, AGQF). Bei AGQE liegt der Fokus auf der Diag­nose von Quarantäneschadinsekten, aber auch neue, nichtendemische Schadinsekten werden bestimmt. Bei offenen Fragen zur Risikobewertung werden sie durch Forschung ergänzend bearbeitet. Die Zuständigkeit gilt insbesondere für Thysanoptera (Thripse), Coleoptera (Käfer, außer Forst/AGQF), Diptera, nur Tephritidae (Fruchtfliegen), und Fulgoridae (Spitzkopfzikaden, z. B. Lycorma delicatula) sowie Heliothis- und Spodoptera-Arten Noctuidae (Eulenfalter). Die langjährige und gut etablierte Diagnose basiert schwerpunktmäßig auf einer morphologischen Bestimmung mittels modernster Lichtmikroskopie (Abb. 1a). Ergänzt wird diese durch molekularbiologische Methoden, die dank der engen Zusammenarbeit mit dem Arbeitsbereich AGQF in Einzelfällen zum Einsatz kommt. Im Rahmen der Akkreditierung seiner Prüfverfahren konzentriert sich AGQE auf die Bestimmung von Ceratitis capitata und Thrips palmi als beispielhafte Arten für ein flexibilisiertes Diagnoseverfahren.

Der entomologische Schwerpunkt der Arbeitsgruppe AGQF umfasst Bock- und Prachtkäfer, hier allem voran der invasive Asiatische Laubholzbockkäfer (ALB) – Anoplophora glabripennis. Diesen betreffend stehen vor allen Dingen die Weiterentwicklung und Verbesserung der Diag­nosemethoden zur Früherkennung des Schaderregers (vgl. ANOPLO-diag-Projekt: https://pflanzen.fnr.de/index.php?id=11381&fkz=22010316) im Vordergrund. Des Weiteren wird in diesem Projekt der Aufbau einer Quarantänezuchtstation für ALB und andere Bockkäfer angestrebt. Hierzu kooperiert die Arbeitsgruppe beispielsweise mit internationalen Pflanzenschutzdiensten in Italien, Schweiz und USA. Das breite Spektrum an molekularbiologischen Methoden, von Real-Time PCR, konventioneller PCR, LAMP bis zum Barcoding, ermöglicht einen effizienten Nachweis bzw. die Identifizierung der für Europa und Deutschland relevanten invasiven Käfer­arten. Der Akkreditierungsbereich – molekularbiologische Diagnoseverfahren für gehölzrelevante Quarantäneschädlingen – beinhaltet durch Flexibilisierung die Abdeckung der Diagnose dieser vielfältigen Schad­insekten.

2.2.2 Diagnose von Insekten im Institut GF (GFE). Am Institut GF werden quarantänerelevante Schadinsekten und Milben mit morphologischen Verfahren auf Art­niveau bestimmt. Die Auswahl der Arten, die bearbeitet wird, richtet sich nach den Vorgaben für das NRL (s. o.), deckt jedoch nur einen Teil davon ab. Die übrigen Schadinsekten werden an anderen Instituten des JKI bearbeitet. GFE konzentriert sich vorwiegend auf gartenbaulich relevante Arten, da hier die Expertise des Instituts liegt. Basierend auf diesen Auswahlkriterien ist es möglich, bestimmte Taxa vollständig zu bearbeiten, zu denen die Blattflöhe (Psylloidea), die Weißen Fliegen (Aleyrodidae) und die Minierfliegen (Agromyzidae) gehören. Aus anderen Gruppen werden einzelne Arten bearbeitet, z. B. Eotetranychus lewisi aus der Familie der Spinnmilben (Tetranychidae) sowie Conotrachelus nenuphar, Naupactus leucoloma und Premnotrypes spp. aus der Familie der Rüsselkäfer (Curculionidae). Für die Bestimmung werden modernste lichtmikroskopische Verfahren verwendet. Dabei wird sowohl der makroskopische sowie der mikroskopische Vergrößerungsbereich abgedeckt. So können morphologische Differentialmerkmale mit bis zu 1000-facher Vergrößerung detailgenau betrachtet und mit hoher Tiefenschärfe fotografisch dokumentiert werden. Für die eindeutige Bestimmung werden Genitalpräparate angefertigt. Die Bestimmungsliteratur wird stetig auf dem neuesten Stand gehalten, wobei auch der rege Austausch mit Fachkollegen auf nationaler und interna­tionaler Ebene von großem Nutzen ist. Derzeit stehen jedoch noch nicht für alle Organismen festgeschriebene Verfahren zur Verfügung. Im Zuge der Akkreditierung werden zunächst zwei flexibilisierte Diagnoseverfahren für die Minierfliegenarten aus der Gattung Liriomyza und für den Blattfloh Trioza erytreae erarbeitet, die neben dem Blattfloh Bactericera cockereli und der Weißen Fliege Bemisia tabaci zu den prominentesten Arten gehören, die am Institut GF bearbeitet werden.

2.2.3 Diagnose von Quarantäneschadinsekten im Institut OW (OWE). Das entomologische Quarantänelabor im Insti­tut OW ist zuständig für Zikaden, Schildläuse und Kleinschmetterlinge (Obst- und Weinbau, Forst, Gartenbau), die als Quarantäneschadorganismen gelistet sind.

Bei den vom NRL zu bearbeitenden Zikaden handelt es sich um Vektoren von Bakterien bzw. Phytoplasmen. Das Bakterium Xylella fastidiosa besiedelt das Xylem seiner Wirtspflanzen und wird daher ausschließlich von xylem­saugenden Zikaden übertragen. Während in Europa bisher nur Schaumzikaden (Aphrophoridae) als Vektoren identifiziert wurden, spielen in der Ursprungsregion des Bakteriums, dem amerikanischen Kontinent, besonders die Vertreter der dort sehr artenreichen Unterfamilie der Schmuckzikaden (Cicadellinae) die wichtigste Rolle als Überträger. Sie sind daher als Quarantäneschadorga­nismen gelistet und ihre Identifizierung ist derzeit ein Schwer­punkt der Arbeit von OWE. Daneben sind die Kleinzikade Hishimonus phycitis als Überträger des Lime witches broom Phytoplasmas und die Glasflügelzikade Haplaxius (Myndus) crudus als Vektor des Palm lethal yellowing Phytoplasmas zu bearbeiten.

Bei den Schildläusen stellt die Familie der Margarodidae die größte Gruppe von quarantänerelevanten Arten. Arten wie Margarodes vitis und Eurhizococcus brasilensis leben an der Wurzel von Reben und können hier Wuchsdepressionen und Absterben der Pflanzen verursachen. Die Schäden ähneln jenen von Rebläusen auf ungepfropften Reben. Arten dieser Gruppe treten vor allem in Südamerika und Südafrika auf. Die Deckelschildläuse aus den Familien der Diaspididae Lopholeucaspis japonica und Unaspis citri sind polyphage Arten und treten in Teilen Europas bereits auf. Ripersiella hibisci ist eine polyphage an Wurzeln lebende Schmierlaus (Fam. Pseudococcidae), die vor allem an Gewächshauspflanzen zu erwar­ten ist. Sie wurde in Europa bereits nachgewiesen.

Bei den über 20 quarantänerelevanten Kleinschmetterlingen aus der Familie der Wickler (Lepidoptera: Tortricidae) handelt es sich überwiegend um Obstschädlinge und Forstschädlinge aus Fernost und Nordamerika. Eine Art aus der Familie der Gelechiidae (Keiferia lycoper­siella) befällt Tomaten in Südamerika.

2.3.1 Diagnose von Kartoffelkrebs (Chytridiomyceten) im Institut A (AKK). Der Kartoffelkrebs Synchytrium endobioticum ist einer der bedeutendsten Quarantäneschaderreger für den Kartoffelanbau. Dieser bodenbürtige Pilz kann durch die Ausbildung von Dauersporen mehr als 40 Jahre im Boden überdauern (Przetakiewicz, 2015). Die vorgeschriebene Sperrung von Befallsflächen stellt so ein langfristiges Problem für den Kartoffelanbau dar. Bis heute sind über 40 Pathotypen beschrieben, die eine unterschiedliche Pathogenität an verschiedenen Kartoffelsorten aufweisen. Da der Anbau resistenter Kartoffelsorten die einzige Möglichkeit für die Eindämmung von Kartoffelkrebs darstellt, ist die Identifikation der Pathotypen von herausragender Bedeutung.

Zu den diagnostischen Methoden im Prüfbereich AKK zählt der Nachweis von S. endobioticum in Boden- und Gewebeproben mittels Nasssiebverfahren (Abb. 1f–h) und Mikroskopie. Für die Identifikation der Pathotypen wird ein Biotest nach der Glynne-Lemmerzahl-Methode eingesetzt. Hierbei wird ein Differentialsortiment von Kartoffelsorten, deren Resistenz gegenüber bestimmten Pathotypen bekannt ist, mit dem zu testenden Material infiziert und anschließend die Anfälligkeit der verschiedenen Sorten beurteilt. Des Weiteren wirkt AKK an der Harmonisierung von Testmethoden auf EU-Ebene mit und war sowohl an der Erarbeitung des EPPO-Standards zur Diagnose von S. endobioticum (PM 7/28, EPPO, 2020) als auch des EPPO-Standards zur Resistenzprüfung beteiligt. Auf nationaler Ebene unterstützt AK die Pflanzenschutzdienste (PSD) der Bundesländer bei der Etablierung und Harmonisierung der Testverfahren. Dazu wurden die Mitarbeiter der PSD in Workshops zur Diagnose von S. endobioticum geschult und bei methodischen und dia­gnostischen Fragen beraten.

2.3.2 Diagnose von Asco- und Basidiomyceten im Institut AG (AGQMy). Die Zuständigkeit des Arbeitsbereiches AGQMy erstreckt sich auf Ascomycota und Basidiomycota, mit Ausnahme von Rost- und Brandpilzen, die im Prüflabor EPM bearbeitet werden. In Rahmen der Referenzfunktion führt das Labor AGQMy die Diagnose von neu auftretenden oder bereits Quarantäneregelungen unterliegenden Pilzarten durch. Die bereits etablierten bzw. nicht mehr geregelten pilzlichen Schadorganismen werden an anderen Instituten gearbeitet. Bei dieser Diagnoseaktivität liegt der Schwerpunkt insbesondere auf der Beteiligung an der Verhinderung der Einschleppung und Verbreitung von Quarantänepilzen, in Zusammen­arbeit mit den Pflanzenschutzdiensten der Länder. Durch die Kontrollstellen in den Bundesländern werden Proben von Importsendungen aus Drittländern, die verdächtige Symptome aufweisen, genommen. Die zu verwendenden diagnostischen Verfahren basieren auf validierten, vorzugsweise molekularen Methoden (cPCR, Real-Time-PCR und DNA-Barcoding) aus EPPO Standards der PM 7 Serie (EPPO, 2020). Entsprechend der für jeweilige Erreger gegenwärtigen Relevanz liegt der Fokus von AGQMy zur Zeit auf Phyllosticta citricarpa (Zitrus-Schwarzfleckenkrankheit) (Abb. 1e), Fusarium circinatum (Pechkrebs der Kiefer), Dothistroma septosporum, Dothistroma pini, Lecanosticta acicola (Dothistroma-Nadelbräune), und Cryphonectria parasitica. Im Rahmen der Akkreditierung seiner Prüfverfahren beteiligt sich AGQMy mit einem flexibilisierten Akkreditierungsbereich und kann somit die Diagnose auch der anderen quarantänerelevanten Pilzarten abdecken. Für diese Schadorganismen sind in der AGQMy-Arbeitssammlung aktuell auch Isolate als Positiv­kontrollen hinterlegt.

2.3.3 Diagnose von Rost- und Brandpilzen im Institut EP (EPM). Mit über 7000 bzw. rund 1500 beschriebenen Arten weltweit stellen die Rost- und Brandpilze zwei der artenreichsten pflanzenparasitischen Gruppen der Pilze. Gegenwärtig sind hiervon 22 Arten als potentielle Quarantäneschadorganismen auf der EPPO A1- und A2-Liste zur Regelung vorgeschlagen. Das Labor EPM strebt eine Flexibilisierung des Akkreditierungsbereiches an, so dass ein umfangreiches Repertoire dieser Rost- und Brand­pilze diagnostiziert werden kann. Die Identifizierung erfolgt dabei durch die molekularphyolgenetische Analyse geeigneter DNA-Regionen, dem sogenannten „DNA-Barcoding“. Exemplarisch wurde die Methode vom Prüflabor EPM für Thekopsora minima (EPPO A2-Liste) validiert.

Der Erreger des Rosts der Nordamerikanischen Strauch­heidelbeere (Vaccinium corymbosum, Ericaceae) wurde zum ersten Mal 2015 für Deutschland und Europa gesichert nachgewiesen (Schrader & Maier, 2015). Die Methode wurde anhand DNA-Sequenzierung der LSU und der ITS-Region der ribosomalen Gene validiert. Es wurde ein detailliertes Protokoll sowie ein Datensatz zur schnellen und einfachen Unterscheidung des invasiven amerikanischen Rostpilzes von nah verwandten Arten entwickelt. Mit dieser Methode kann Thekopsora minima auch eindeutig von Naohidemyces vaccinii, dem Erreger des Rosts der Europäischen Heidelbeere (Vaccinium myrtillus) unterschieden werden.

Dieser und weitere kuratierte Datensätze werden nach der Validierung den Pflanzenschutzdiensten künftig zur Verfügung gestellt, um ihnen nach der DNA-Sequenzierung die eindeutige Einordnung der Schadorganismen selbst zu ermöglichen.

2.3.4 Diagnose von Oomyceten-Arten im Institut GF (GFO). Eine der wirtschaftlich bedeutendsten phytopathogenen Mikroorganismengruppe ist die Gattung Phytophthora. Phytophthora-Arten sind pilzähnliche Mikro­organismen und gehören systematisch zu den Oomycota aus dem Reich der Chromista. Zu der Gattung zählen über 150 Arten, die weltweit massive Pflanzenschäden verursachen können. Gefürchtet sind nicht nur Arten, die Kulturen in den Gartenbaubetrieben befallen, sondern besonders die Phytophthora-Arten, die Pflanzen im Kontext von Baumschulen, urbanem Grün und in Waldgebieten schädigen, wo eine chemische Bekämpfung nicht möglich ist. Zu diesen Phytophthora-Arten zählen unter anderem die Quarantäneschadorganismen P. ramorum P. lateralis und P. kernoviae.

Der Prüfbereich GFO führt seit vielen Jahren die Dia­gnose von P. ramorum und P. kernoviae durch und war an der Erarbeitung des EPPO Diagnoseprotokolls PM 7/66 (1) für Phytophthora ramorum beteiligt. In nationalen und internationalen Forschungsprojekten (EU, USA) wurden epidemiologische Grundlagen zu diesem bedeutenden Schadorganismus mit erarbeitet, die maßgeblich zur Erstellung der Risikoanalyse beigetragen haben.

Die Diagnose von Phytophthora-Arten aus pflanzlichen Materialien, Substraten und Wasser erfolgt mit unterschiedlichen Methoden aus den Bereichen Molekularbiologie, Mikrobiologie und Morphologie. Molekularbiologisch findet die Diagnose hauptsächlich mittels konven­tioneller PCR oder Real-Time PCR statt. Zusätzlich werden die Pathogene isoliert und sowohl morphologisch anhand der typischer Weise auftretenden Strukturen (Lichtmikroskopie) als auch durch Sequenzanalyse bestimmt.

Eine besondere Herausforderung stellt die Isolierung von Phytophthora-Arten aus Substraten und Wasser dar. Dazu wurde in der Arbeitsgruppe erstmalig in Europa ein Köderverfahren mit Rhododendronblättern validiert (Junker et al., 2018). Da nur intakte Strukturen von P. ramorum das unverletzte Blattgewebe infizieren können, gibt das Verfahren auch Auskunft über die Vitalität des Erregers in der untersuchten Probe.

Weiterhin werden von GFO regelmäßig Eignungsprüfungen angeboten, bei denen die amtlichen Diagnose­labore der Bundesländer u. a. ihre Kompetenz überprüfen und belegen können. Insbesondere gilt es dabei P. ramorum und P. kernoviae aus kontaminiertem Substrat zu isolieren und anschließend mittels morphologischer und molekularbiologischer Analyse eindeutig nachzuweisen.

Der Prüfbereich GFO unterhält eine Stammsammlung mit ca. 1350 Isolaten, die ca. 67 Phytophthora-Arten zuge­rechnet werden können. Diese dienen zum einen als internes Referenzmaterial für alle Untersuchungen im Rahmen des NRL. Zum anderen können sie auf Anfrage als nicht-zertifiziertes Referenzmaterial den Diagnose­laboren der Pflanzenschutzdienststellen zur Verfügung gestellt werden.

2.4.1 Diagnose forstlicher Quarantänenematoden im Institut AG (AGQF). Das zoologisch orientierte forstliche Quarantänelabor befasst sich mit Gehölz- und forstlich relevanten Quarantäneschadorganismen; fachlich ist dieser Bereich sehr breitgefächert und als eine Schnittstelle zu den anderen Quarantänelaboren Entomologie, Mykologie und Nematologie aufgestellt. Von der bereits erwähnten, 20 Arten umfassenden Liste der Prioritären Schädlinge sind allein 9 von unmittelbarer Gehölz- bzw. forstpathologischer Relevanz. Hoppe et al. (2020a) liefern hierzu eine Kurzcharakterisierung zu den entsprechenden Organismen. Einen besonderen fachlichen Schwerpunkt umfasst der seit 1999 in der EU (Portugal und Spanien) nachgewiesene Kiefernholznematode Bursaphelenchus xylophilus. Neben Monitoring, Diagnose und Erarbeitung von Notfallmaßnahmenplänen wird aktiv an der Lebenderhaltungszucht von 48 Bursaphelenchus-Arten gearbeitet. Diese umfangreiche Sammlung ist eine der größten ihrer Art weltweit und beteiligt sich an der Bereitstellung von Referenzmaterial (vgl. Hoppe et al., 2020b in diesem Themenheft). Die entomologischen Schwerpunkte von AGQF werden unter 2.2.1 erläutert.

2.4.2 Diagnose von Quarantänenematoden im Institut AG (AGQN). Der Prüfbereich AGQN bearbeitet in seiner Zustän­digkeit alle geregelten phytopathogenen Nematoden, ausgenommen Arten im Bereich Forst (Bursaphelenchus xylophilus). Der Fokus liegt auf Kartoffelzysten­nematoden (Globodera pallida, G. rostochiensis) und nicht in Deutschland heimischen Meloidogyne-Arten (M. chitwoodi und M. fallax). Ebenfalls von großer Bedeu­tung sind die als Unionsquarantäne-Nematoden geregelten Arten der Gattungen Hirschmanniella spp. (5 Arten), Longidorus diadecturus, Nacobbus abberans und nicht europäische Xiphinema Arten/Population, die in Deutschland bislang sehr eingeschränkt auftreten. Die Diagnosemethoden umfassen auch morphologische Unter­suchungen, die aber in jedem Fall molekularbiologisch zu verifizieren sind. Den größten Umfang an Untersuchungen und Regelungen nehmen dabei die Kartoffelzystennematoden ein. Kartoffelzystennematoden werden dabei mittels eines dichtebasierten Verfahrens nach Oostenbrink (1960) aus Bodenproben extrahiert und anschlie­ßend morphologisch auf Gattungsebene anhand der Zystenform identifiziert. Die Artidentifikation von Nematoden ohne „vulval cone“ als typischem Merkmal der Gattung Globodera erfolgt mittels konventioneller PCR und gelelektrophoretischer Auftrennung der entstandenen PCR-Produkte. Barcoding-Sequenzierung wird zukünftig ebenfalls genutzt, um den Nachweis bzw. die Identifizierung aller übrigen Nematoden-Arten zu sichern. Das zu akkreditierende Prüfverfahren im flexi­blen Akkreditierungsrahmen beinhaltet gegenwärtig Globodera rostochiensis und Globodera pallida (Abb. 1d). Weiterhin wird im Prüfbereich AGQN eine etwa 200 Populationen umfassende Arbeitssammlung zur Gattung Globodera, welche neben den Kartoffelzystennematoden Globodera pallida und G. rostochiensis auch nahe verwandte Arten wie Globodera tabacum, G. artemisae und G. millefolii beinhaltet, erhalten und kontinuierlich vermehrt. Eine kleinere Arbeitssammlung zu den regulierten Nicht-Quarantäne-Schädlingen der Gattung Ditylenchus umfasst sieben Population von D. dipsaci (3) und D. destructor (4).

2.5.1 Diagnose von Phytoplasmen als Quarantäneschadorganismen im Institut OW (OWP). Phytoplasmen sind besonders im Obst- und Weinbau als Schaderreger von großer Bedeutung. Daher ist der Arbeitsbereich ‚Phytoplasmen‘ im Institut OW für alle als Quarantäneschaderreger eingestufte Phytoplasmen zuständig. Die Phytoplasmen werden durch spezifische PCR- und qPCR-Verfahren nachgewiesen. Das Spektrum der Erreger umfasst das im europäischen Weinbau sehr schädliche Grapevine Flavescence dorée Phytoplasma sowie außereuropäische Phytoplasmen an Obst, Weinreben und Palmen. Die Diagnose der Flavescence dorée stellt derzeit einen Schwerpunkt dar. Die Krankheit kann anhand der Symptome nicht von anderen Phytoplasmosen der Rebe unterschieden werden, breitet sich jedoch im Gegensatz zu diesen epidemisch aus, da sie durch die eingeschleppte amerikanischen Rebzikade Scaphoideus titanus sehr effek­tiv von Rebe zu Rebe übertragen wird. Für eine eindeutige Differenzierung zwischen dem Grapevine Flavescence dorée Phytoplasma und ähnlichen, von S. titanus nicht übertragbaren Phytoplasmen in Wildpflanzen und Reben sind DNA-Sequenzanalysen erforderlich.

Als RNQP werden die mit Obstphytoplasmosen asso­ziierten Schaderreger Candidatus Phytoplasma mali (Apfel­triebsucht), Candidatus Phytoplasma prunorum (Europäische Steinobstvergilbung) und Candidatus Phytoplasma pyri (Birnenverfall) sowie der Erreger der Schwarzholzkrankheit (Bois noir) der Rebe, Candidatus Phytoplasma solani, bearbeitet.

2.6.1 Diagnosen von Viren und Viroiden im Institut EP (EVP). Zahlreiche Pflanzenviren und –viroide gefährden den erfolgreichen Anbau von Kulturpflanzen. Die Mehrzahl diese Schadorganismen hat einen sehr weiten Wirtskreis, so dass zahlreiche Kombinationen von Matrix und Prüfling möglich sind. Dazu kommen verschiedene Nachweismethoden, insbesondere serologische und mole­kularbiologische Tests, die einen generischen oder sehr spezifischen Virus-/Viroidnachweis ermöglichen. Es ist daher angestrebt, sich „flexibel“ für mehrere Nachweisverfahren zu akkreditieren und diese dann auf spezifische Schadorganismen anzuwenden. Im Fokus der Akkre­ditierung stehen daher verschiedene serologische Nachweise (insbesondere DAS-ELISA) und molekularbiologische Nachweise (RT-PCR, qRT-PCR) für Schad­erreger an Tomaten: tomato brown rugose fruit virus (Tobamovirus mit erheblichem Schadpotenzial (Wilstermann & Ziebell, 2019)), pepino mosaic virus, Pospiviroide sowie physostegia chlorotic mottle virus. Weitere Vor­gaben werden z. B. durch das EURL erstellt, so dass zukünftig auch Nachweisverfahren für tomato leaf curl New Delhi virus und rose rosette virus etabliert werden müssen und sich somit die Liste der Prüfverfahren sowie Prüflinge kontinuierlich erweitert.

Das Prüflabor EPV verfügt über eine große Sammlung von Virusisolaten von geregelten und nicht-geregelten Pflanzenviren und –viroiden, die auf lebenden Pflanzen erhalten werden oder auf verschiedene Weise konserviert wurden (z. B. Gefriertrocknung, Einfrieren) und als Kontrollen für Nachweisverfahren dienen. Aus den Vorgängerinstitutionen des JKI (Biologische Bundesanstalt, Bundesanstalt für Züchtungsforschung) wurde eine umfassende Antiserumsammlung übernommen; derzeit sind rund 2000 polyklonale Antiseren gelistet, die für den Virusnachweis eingesetzt werden können; hinzu kommen zahlreiche monoklonale Antikörper. Bereits in der Vergangenheit gab es eine enge Zusammenarbeit mit Pflanzenschutzdiensten im Bereich Diagnostik und Fortbildung.

2.6.2 Diagnose von Viren als Quarantäneschadorganismen im Institut OW (OWV). In den Aufgabenbereich des Quarantänelabors Virologie im Institut OW fallen nicht-europäische Viren, die hauptsächlich Zitruspflanzen, Beeren- und Steinobst befallen. Das peach rosette mosaic virus (PRMV; Gattung Nepovirus) richtet überwiegend Schaden an Pfirsich an, wurde aber auch bereits an Weinreben diagnostiziert. Das peach mosaic virus (PcMV; Gattung Trichovirus) sowie das cherry rasp leaf virus (CRLF, Rauhblättrigkeit der Kirsche; Gattung Cheravirus) sind weitere Quarantäneschaderreger des Pfirsichs.

Daneben weisen Beerenobst schädigende Viren wie das blueberry leaf mottle virus (BLMoV; Gattung Nepo­virus), das raspberry leaf curl virus (RLCV; unclassified) und das black raspberry latent virus (BRLV; Gattung Ilarvirus) Quarantänestatus auf.

Als Quarantäneviren der Zitruspflanzen sind das Satsuma dwarf virus (SDV; Gattung Sadwavirus; mit Satsumamandarinenbaum, Sojabohne und anderen Zitrus­gewächsen als Wirtspflanzen) und der citrus leprosis Viruskomplex gelistet. Die citrus leprosis Krankheit führt zu enormen Schäden an Zitruspflanzen und ist mit mindestens fünf verschiedenen Viren assoziiert: citrus leprosis virus C (CiLV-C), citrus leprosis virus C2 (CiLV-C2), hibiscus green spot virus 2 (HGSV-2), citrus leprosis virus N sensu novo (CiLV-N; Gattung Dichorha­virus) und dem Zitrusstamm des orchid fleck dichorhavirus (alle den Rhabdoviridae bzw. Kitaviridae zugehörig). Citrus leprosis breitet sich derzeit auf dem amerikanischen Kontinent aus, wurde aber kürzlich ebenfalls in Südafrika detektiert. Eine weitaus größere Verbreitung weisen jedoch die Vektoren dieser Viren auf. Milben der Gattung Brevipalpus sind in Europa vorhanden. Dies hat großen Einfluss auf die phytosanitären Risiken der citrus leprosis Viren. Ein Focus von OWV liegt auf dem Nachweis des American plum line pattern virus (APLPV; Gattung Ilarvirus), das bisher vor allem in Amerika, Asien und Ozeanien auftrat, aber bereits in Italien nachgewiesen wurde. Die Detektion von APLPV mittels Reverser Transkription-PCR soll als Grundlage für ein flexibel akkre­ditiertes Prüfverfahren dienen.

Im Bereich der Quarantäneviren kommt neben den vorrangig eingesetzten molekularen Detektionsmethoden das immunologische Verfahren ELISA zum Einsatz.

Neben phytopathogenen Viren mit Quarantänestatus werden am Institut OW im Bereich Virologie Regulierte Nicht-Quarantäne-Schaderreger (RNQP) wie das Sharka­virus (plum pox virus; PPV), die Blattrollkrankheit auslösenden Rebviren grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1) und grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) sowie little cherry virus 1 und 2 (LChV-1 bzw. LChV-2; Kleinfrüchtigkeit der Kirsche) bearbeitet.